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miRNA cDNA*鏈合成試劑盒說明書

miRNA cDNA Kit

miRNA cDNA*鏈合成試劑盒

目錄號：YJ2141

保存條件：-20℃保存。

組分說明

             Cat. No.                              YJ2141

             Kit Size                               25  次

             1mM Tris，PH8.0                          1 ml

             E. coli    Poly(A) Polymerase(5U/μl)   15 μl

             10×Poly(A) Polymerase Buffer           80 μl

             10mM ATP                               15 μl

             25μM RT primer                         90 μl

             5×RT Buffer                            120 μl

             超純dNTPs(10mM each)                     30 μl

             SuperRT Reverse Transcriptase          15 μl

             RNase-Free Water                        1 ml

            本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡介

　　本試劑盒采用在miRNA  3’末端加多聚A尾的方法來使miRNA具有Poly(A)尾，之后再使用Oligo(dT)-Universal  tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應，zui終合成miRNA對應

的*鏈cDNA。

　　miRNA cDNA*鏈合成試劑盒包含miRNA  3’末端Poly(A)尾修飾過程及修飾后逆

轉(zhuǎn)錄過程需要的全部試劑。該試劑盒具有非常高的 Poly(A)修飾和逆轉(zhuǎn)錄效率，可以從

1 ng-2 μg的total  RNA中有效獲得miRNA對應的cDNA*鏈。并且操作簡便、快捷，

可以用于從一個反應合成的cDNA中同時檢測多種miRNA，不僅減少了誤差、節(jié)約了樣

品，同時還實現(xiàn)了檢測的高通量。

備注：本試劑盒須與miRNA熒光定量檢測試劑盒（YJ2142）配套使用。

自備實驗材料：1 ng-2 μg的總 RNA，或0.1 ng-1 μg的小分子RNA。

注意事項

預防RNase污染，應注意以下幾方面：

1．使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2．玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5  M NaOH中浸泡

   10分鐘，用水*沖洗后高壓滅菌。

3．配制溶液應使用無RNase的水。

4．操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

操作步驟

A．miRNA加Poly(A)尾的過程：

1．首先根據(jù)所用RNA的量，按如下公式，用1 mM Tris（PH8.0）來稀釋10 mM ATP：

                        ATP稀釋系數(shù)=5000/__ng的總RNA

   例：如果總RNA的起始用量為100 ng，那么ATP稀釋系數(shù)=5000/100=50。即將ATP 

   稀釋50倍（1 μl的10 mM ATP加49 μl的1 mM Tris，PH8.0）。

2．向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入以下試劑至總體積25 μl。

            試劑                                    體積          終濃度

            total RNA*                            X μl       可達2 μg

            10×Poly(A) Polymerase Buffer          2.5 μl        1×

            第“1"步中稀釋好的ATP                         1 μl          —

            E. coli    Poly(A) Polymerase（5U/μl）  0.5 μl       2.5 U

            RNase-Free Water                   up to 25 μl      —

                      *反應中使用的total RNA必須含有小分子RNA。

   此過程也可以直接使用小分子RNA（建議加入量為2-5  μl。請根據(jù)目的miRNA的豐

   度來確定加入量）。

3．輕輕混勻上述反應液，短暫離心將液體收集于管底。37℃，孵育15分鐘。此過程結(jié)

   束后，立刻進行*鏈cDNA的合成，或于-20℃暫存。如需長期保存，建議存放于

   -80℃。

B．修飾后的miRNA cDNA*鏈合成的過程：

1．向冰浴中預冷的無RNase反應管中加入下表中試劑，至終體積20 μl：

                     試劑                               體積

                     上述Poly(A)反應液                      4 μl

                     超純dNTPs(10mM each)                1 μl

                     25μM RT primer                    3 μl

                     5×RT Buffer                       4 μl

                     SuperRT Reverse Transcriptase    0.5 μl

                     RNase-Free Water                 7.5 μl

2．輕輕混勻上述反應液，短暫離心將液體收集于管底。42℃，孵育50分鐘。

3．85℃，孵育5分鐘，終止反應。合成的  cDNA反應液可以直接進行熒光定量檢測實

   驗，也可以于-20℃保存?zhèn)溆谩?/SPAN>

    相關產(chǎn)品信息

                目錄號             產(chǎn)品名稱

                YJ0627          miRNA提取試劑盒

                YJ2141          miRNA cDNA*鏈合成試劑盒

                YJ2142          miRNA熒光定量  PCR檢測試劑盒